Zemljevid CČN

Metodologija in interpretacija rezultatov

Epidemiološko spremljanje virusa SARS-CoV-2 v odpadnih vodah predstavlja komplementaren sistem spremljanja okužb s SARS-CoV-2, ki omogoča prostorsko in časovno spremljanje okužb s SARS-CoV-2 na populacijski ravni. Deluje na principu kvantitativne analize izločene ribonukleinske kisline (RNK) virusa v odpadnih vodah, ki se stekajo v čistilne naprave. Na podlagi analiz obremenitev odpadne vode z izločenim RNK virusa lahko pridobimo informacije o razširjenosti virusa v opazovani populaciji, ki jo predstavljajo vsi priključeni na posamezno čistilno napravo, neodvisno od tega, ali imajo izražene bolezenske znake, lahko tudi le blago izražene ali pa so brez bolezenskih znakov (1). Čeprav je SARS-CoV-2 virus, ki povzroča obolenje dihal, ga 48,1 % bolnikov izloča tudi z odvajanjem blata (2).

Cilj epidemiološkega spremljanja RNK SARS-CoV-2 v odpadnih vodah je spremljanje trendov kroženja virusa SARS-CoV-2 med prebivalstvom z namenom informiranja splošne in strokovne javnosti ter odločevalcev o razširjenosti virusa SARS-CoV-2.

Spremljanje SARS-CoV-2 v odpadnih vodah se izvaja v vseh 12 statističnih regijah v Republiki Sloveniji. V spremljanje je vključenih 16 komunalnih čistilnih naprav (KČN), v katere se stekajo odpadne vode 730.887 (34,4 %) prebivalcev Slovenije iz 33 občin. Seznam vključenih KČN, vključenih občin in delež prebivalstva statistične regije, ki je priključen na spremljane čistilne naprave, so prikazani v Tabeli 1.

Vzorčenje odpadnih voda na prisotnost SARS-CoV-2 v odpadnih vodah se izvaja enkrat tedensko na vseh vključenih KČN od septembra 2022 naprej.

Metodologija laboratorijske analize

V skladu s priporočili Evropske komisije 2021/472 (3) se odvzamejo 24-urni vzorci vtoka odpadne vode z uporabo časovno sorazmernega vzorčevalnika. Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano (NLZOH) tedensko na čistilnih napravah z usposobljenim osebjem izvaja vzorčenje vzorca dotoka odpadne vode. Vsak vzorec spremlja zapisnik o vzorčenju, ki vsebuje natančne podatke o času vzorčenja, pretoku, temperaturi vode in številne druge parametre. Vsak vzorec je analiziran na kemijske parametre (el. prevodnost, pH, neraztopljene snovi, celotni dušik, fosfor, kemijska potreba po kisiku). Mikrobiološka analiza ugotovalja in določa prisotnost kopij specifičnega gena SARS-CoV-2 v litru odpadne vode, kar omogoča natančno opredelitev vseh parametrov in s tem celostno interpretacijo rezultatov. Proces mikrobiološke analize vzorcev odpadne vode se prične v roku 24-ih ur po odvzemu. Vzorci so do obdelave shranjeni pri temperaturi od +4 do +8 °C. V mikrobiološkem laboratoriju vzorce po predhodnem centrifugiranju (odstranitev neraztopljenih snovi), koncentrirajo z ultrafiltracijo, iz koncentrata pa nato osamijo RNK ter kvantitativno določijo genomske kopije SARS CoV-2. Za zagotavljanje kakovosti so v postopek vključene procesne in interne kontrole.

V vseh testiranih vzorcih se s sekveniranjem in bioinformatsko obdelavo podatkov izvede še določanje mutacij genoma SARS CoV-2, ki so značilne za posamezne različice (4). S pomočjo bioinformatskega orodja Freyja, specializiranega za analizo kompleksnih vzorcev se izvedejo meritve frekvence točkovnih mutacij in globina sekveniranja na vsakem mestu v genomu, kar se nato uporabi za oceno zastopanosti deležev posameznih različic v vzorcih odpadne vode (5).

Vzorčenje odpadne vode in laboratorijske analize izvaja NLZOH.

Metodologija epidemiološkega spremljanja

Obremenitve odpadne vode z virusom SARS-CoV-2 so bile pretvorjene v ocenjeno število okuženih oseb. Metodologija priprave te ocene je povzeta po raziskavi Daleiden et al. (6). Proces priprave poteka v dveh korakih. V prvem koraku je bilo RNK virusno breme odpadne vode (prisotnost SARS-CoV-2 gen N3) normalizirano na kvantificirane vrednosti kemijske potrebe po kisiku v istih vzorcih. V drugem koraku je bil z namenom lažjega razumevanja normalizirane vrednost virusnega bremena SARS-CoV-2 določen pretvorbeni faktor prileganja virusnega bremena v odpadnih vodah s podatki aktivnih primerov okužb SARS-CoV-2. Pretvorbeni faktor je bil na podlagi kliničnega testiranja (7) določen eksperimentalno z linearno regresijo, pri čemer je bil uporabljen 10 dnevni časovni zamik. Podatki so bili predhodno transformirani z logaritemsko funkcijo, osamelci so bili odstranjeni.

Predstavitev kazalnikov

Virusno breme na 100.000 populacijskih ekvivalentov (PE): normalizirana vrednost kopij SARS-CoV-2 gen N3 v litru odpadne vode na kvantificirane vrednosti kemijske potrebe po kisiku v istih vzorcih. Podatek se prikazuje v številu genskih kopij virusa na dan vzorčenja na 100.000 populacijskih ekvivalentov (PE). (Ti podatki niso prikazani, so pa dostopni na portalu Odprti podatki Slovenije (OPSI)).

Ocenjeno število okuženih oseb s SARS-CoV-2 na 100.000 prebivalcev: kazalnik prikazuje ocenjeno število okuženih oseb s SARS-CoV-2 na 100.000 prebivalcev na dan odvzema vzorca odpadne vode na vtoku čistilne naprave. Z namenom lažjega razumevanja je normalizirana vrednost virusnega bremena SARS-CoV-2 prilegana na aktivne primere okužb s SARS-CoV-2, izhajajoč iz kliničnih podatkov testiranja. Posamezne izraziteje odstopajoče vrednosti kazalnika so posledica izjemne kompleksnosti sestave odpadnih voda, katera je odvisna od številnih antropoloških in okoljskih dejavnikov.

Delež mutacij genoma SARS-CoV-2: kazalnik prikazuje oceno zastopanosti (v %) posamezne različice virusa SARS-CoV-2 v vzorcu odpadne vode na vtoku čistilne naprave, ki temelji na določitvi za posamezno različico značilnih mutacij genoma RNK SARS-CoV-2.

Interpretacija rezultatov

Pri interpretaciji rezultatov spremljanja SARS-CoV-2 v odpadnih vodah je potrebno upoštevanje naslednjih značilnosti tovrstnega epidemiološkega spremljanja:

• Cilj epidemiološkega spremljanja RNK SARS-CoV-2 v odpadnih vodah je spremljanje trendov kroženja virusa SARS-CoV-2 med prebivalstvom z namenom informiranja splošne in strokovne javnosti ter odločevalcev o razširjenosti virusa SARS-CoV-2.
• Ocenjeno število okuženih oseb s SARS-CoV-2 zajema vse okužene osebe s SARS-CoV-2, ki so priključene na posamezno čistilno napravo. To pomeni, da so vključene vse osebe, neodvisno od tega ali imajo izražene bolezenske znake, lahko tudi le blago izražene ali pa so brez bolezenskih znakov.
• Krivulja aktivnih primerov na podlagi humanega testiranja ima od 4 do 14 - dnevni časovnik zamik glede na krivuljo ocenjenega števila okuženih oseb s SARS-CoV-2 na podlagi rezultatov spremljanja virusne RNK v odpadni vodi
• Odpadna voda, ki se steka na čistilno napravo, najpogosteje vsebuje komunalne vode iz gospodinjstev in drugih dejavnosti, padavinske vode ter industrijske vode. Odpadna voda tako predstavlja izjemno kompleksen sistem mikrobioloških organizmov in kemijskih spojin, katerih vrednosti v odpadni vodi so odvisne od številnih antropoloških in okoljskih dejavnikov. Navedene dejavnike, ki vplivajo na količino odpadne vode in njihovo sestavo, smo z izbranim metodološkim pristopom izračuna epidemiološkega kazalnika izključili v največji možni meri.

Dostopnost podatkov

Podatki epidemiološkega spremljanja SARS-CoV-2 v odpadnih vodah v Sloveniji so v strojno berljivi obliki dostopni na portalu Odprti podatki Slovenije (OPSI).

Interaktivni prikazi na tej spletni strani so trenutno prilagojeni za spremljanje preko računalnika, prilagoditev za spremljanje preko mobilnih naprav bo narejena naknadno.

Literatura

1. Jones DL, Baluja MQ, Graham DW, Corbishley A, McDonald JE, Malham SK, et al. Shedding of SARS-CoV-2 in feces and urine and its potential role in person-to-person transmission and the environment-based spread of COVID-19. Science of the Total Environment 2020; 749. Dostopno na: https://10.1016/j.scitotenv.2020.141364.
2. Foladori P, Cutrupi F, Segata N, Manara S, Pinto F, Malpei F, et al. SARS-CoV-2 from faeces to wastewater treatment: What do we know? A review. Sci Total Environ 2020; 743. Dostopno na: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.140444.
3. Priporočilo Komisije (EU) 2021/472 z dne 17. marca 2021 o skupnem pristopu za vzpostavitev sistematičnega spremljanja virusa SARS-CoV-2 in njegovih različic v odpadnih vodah v EU. Uradni list Evropske unije, 2021. Dostopno na: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/SL/TXT/PDF/?uri=CELEX:32021H0472&from=ES.
4. Grubaugh ND, Gangavarapu K, Quick J, Matteson NK, De Jesus JG, Main BJ, et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar“. Genome Biology 2019; 20(1):8. Dostopno na: https://doi.org/10.1186/s13059-018-1618-7.
5. Karthikeyan S, Levy JI, De Hoff P, Humphrey G, Birmingham A, Jepsen K, et al. Wastewater sequencing reveals early cryptic SARS-CoV-2 variant transmission. Nature 2022; 609:101–108. Dostopno na: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05049-6.
6. Daleiden B, Niederstätter H, Steinlechner M, Wildt S, Kaiser M, Lass-Flörl C, et al. Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 in Austria: development, implementation, and operation of the Tyrolean wastewater monitoring program. J Water Health 2022; 20(2):314–28. Dostopno na: https://doi.org/10.2166/wh.2022.218.
7. Metode epidemiološkega spremljanja števila umrlih oseb s potrjeno okužbo s SARS-CoV-2. Dnevno spremljanje okužb SARS-CoV-2 (COVID-19). Dostopno na: https://nijz.si/nalezljive-bolezni/koronavirus/dnevno-spremljanje-okuzb-s-sars-cov-2-covid-19/.